Несмотря на то, что всё больше в клиниках начинают использоваться методы генетического фенотипирования опухолей, ИГХ исследование остается на сегодня основным помощником в расшифровки биологии рака молочной железы, в прогнозировании его дальнейшего развития, “предсказателем” ответа опухоли на запланированное лечение.
В этой статье вы узнаете: что такое иммуногистохимическое (ИГХ) исследование, какое значение ИГХ имеет при раке молочной железы.
Гистохимия (окрашивание срезов в гистологии)
Перед тем, как патологоанатом (морфолог) начнёт рассматривать под микроскопом участок ткани молочной железы, полученный в результате биопсии, ему необходимо его окрасить специальными красителями.
Гистохимические красители наносят на тонкий срез участка ткани, чтобы рассмотреть под микроскопом, какие клетки там присутствуют, их расположение по отношению друг к другу (структуру ткани). Световая микроскопия является рутинным методом изучения окрашенных срезов ткани, широко используется в диагностике рака молочной железы. Наиболее часто для окрашивания срезов ткани используют:
- Гематоксилин — окрашивает клеточное ядро в темно-синий цвет;
- Эозином — делает цитоплазму клеток розовой. Совместное их использование называется гематоксилин-эозиновое окрашивание.
Что такое иммуногистохимия (ИГХ)
Патологоанатом — это врач, который долго учился в медицинском университете, чтобы знать, как с помощью микроскопа отличить в окрашенном срезе ткани раковые клетки от нормальных. Обычно для постановки диагноза (доброкачественная это патология или злокачественная) ему достаточно рассмотреть под микроскопом срез ткани, окрашенный гематоксилином и эозином. Но иногда этого бывает недостаточно. В такой ситуации на помощь приходит иммуногистохимия, которая к морфологической идентификации клеток и тканей добавляет иммунологический компонент.
Методика иммуногистохимии (ИГХ) дополняет морфологическое распознавание клеток и тканей, используя антитела к известным антигенам, которые являются специфическими для определенных типов клеток или клеточных компонентов. Расположение этих антител можно увидеть, используя световую микроскопию, так как антитела содержат зрительно-распознающиеся метки.
Первые методики иммуногистохимического анализа рака молочной железы использовали антитела с прикрепленными к ним флуоресцирующими метками, что требовало применения специального флуоресцентного микроскопа, позволяющего увидеть локализацию этих антител в срезе ткани молочной железы.
За последние 30 лет удалось существенно упростить методику, которая применяется при ИГХ исследовании молочной железы, за счет использования более специфичных антител (моноклональных антител) с ферментативными метками. Это, в свою очередь, позволило при иммуногистологических исследованиях молочной железы использовать световую микроскопию, которая намного дешевле, и поэтому наиболее доступная. Однако радиоактивные элементы (пероксидаза, щелочная фосфатаза и флуоресцеин), без которых иногда не обойтись, требуют специальных методик и до сих пор широко используются.
Необходимость использования иммуногистохимии при раке молочной железы, контроль её качества и интерпретация полученных результатов должны контролироваться патоморфологическим отделением. Важно, чтобы расшифровка полученных данных при ИГХ исследовании использовалась только в сочетании с морфологическим анализом тканей молочной железы, полученным в результате покраски их гематоксилином и эозином.
Сегодня иммуногистохимическое исследование при раке молочной железы является рутинным методом в большинстве морфологических (патогистологических) лабораториях и используется для уточнения диагноза, а также с прогностической целью, в качестве предикативного (предсказывающего) указателя, как поведет себя рак молочной железы в дальнейшем.
Диагностика рака груди и ИГХ
Когда патологоанатом рассматривает под микроскопом биопсийный материал, перед ним стоит две основные диагностические задачи: определить происхождение опухолевых клеток, где они появились (в протоках, в дольках или в других участках молочной железы) и подтвердить или исключить их вторжение в близлежащие ткани.
Диагностические ИГХ маркеры, применяемые при раке груди
С первых дней использования ИГХ в онкологии велся поиск новых и совершенствовались уже существующие технологии применения антител, которые могли бы идентифицировать антигены клеток с высокой степенью специфичности и чувствительности. Перечисленные ниже ИГХ маркеры в настоящее время широко используются для уточнения гистопатологического диагноза рака молочной железы:
Цитокератины
- CK5, CK10, CK14 и CK17 являются цитокератинами базального слоя эпителия, экспрессируются миоэпителиальными клетками.
- CK5/6 или “базальные цитокератины» помогают распознать нормальные клетки молочной железы как миоэпителиальные, так и ламинарные (секретирующие).
- 34β12: это антитело помогает распознать цитокератины 1, 5, 10 и 14.
Маркеры гладких мышц
- Н-caldesmon. Его можно найти только в миоэпителиальных клетках молочных протоков, поэтому он обладает высокой специфичностью.
- Гладкомышечный актин (SMA). Это антитело помогает обнаружить актин в микрофиламентах; низкая специфичность, так как SMA обнаруживается в фибробластах (в тканях, которые регенерируют).
- Миозин тяжелых цепей гладких мышц (SMMHC) — структурный компонент миозина гладких мышц в SM2 изоформе. Экспрессируется миоэпителиальными клетками молочной железы, обладает высокой чувствительностью и специфичностью, так как SMMHC присутствует только в миоэпителиальных клетках, расположенных в протоках и дольках молочной железы, но отсутствует в фибробластах соединительной ткани железы.
- Calponin — полипептид, 34 кДа, модулирует активность актомиозина. Хорошая чувствительность, но присутствует в фибробластах соединительной ткани молочной железы.
- P63-p53 гомолог — ядерный маркер, весьма чувствительный к миоэпителиальным клеткам.
- CALLA: эндопептид, который экспрессируется в миоэпителиальных клетках.
- P-cadherin — молекула клеточной адгезии с высокой чувствительностью к миоэпителиальным клеткам нормальной ткани молочной железы. Не вступает в реакцию с фибробластами.
Другие маркеры
- Е-кадгерин — молекула клеточной адгезии. Используется, чтобы отличить протоковую карциному “in suti” (DCIS) от дольковой. Карциномы “in suti” (LCIS) — DCIS, как правило, выявляются по окрашиванию мембраны, в отличие от LCIS, при которой её нет.
- Маркеры меланомы: S100, Melan-A, HMB45.
- Маркеры лимфоцитов: CD20, LCA, CD15, CD30.
- Маркеры эндотелия сосудов: CD31, CD34, фактор VIII, d2-40 (podoplanin).
- Маркеры клеточной пролиферации: Ki67, MIB-1, PPh3.
- Маркеры апоптоза: Bcl-2 и Вах, Bcl-X.
Примеры использования ИГХ для разрешения проблем, возникших при определении патологии молочной железы
Существует много ситуаций, когда иммуногистохимия способствует постановке заключительного патогистологического диагноза при патологии молочных желез:
- Окрашивание e-кадгерином клеточной мембраны позволяет исключить дольковые неоплазии (ALH) и LCIS. Отсутствие окрашивания клеточной мембраны говорит в пользу дольковых опухолей.
- Обычная гиперплазия эпителия, или это эпителиальная атипия, или это DCIS. При доброкачественной гиперплазии можно обнаружить реактивность к CK5/6 и CK14, тогда как при атипической гиперплазии и DCIS её нет.
Это микро-инвазивная карцинома или что-то другое? Применение маркеров миоэпителиальных клеток имеет значение при оценке, присутствует или нет микро-инвазия карциномы (вторжение из ламинарного слоя в миоэпителиальный слой клеток). Реактивность фибробластов, разрыв в окрашивании клеток, окрашивание миоэпителиальных клеток гладких мышц сосудов могут вызвать затруднения в интерпретации наблюдаемой картины под микроскопом. В этой ситуации используются два маркера миоэпителиальных клеток, например, p63 и SMMHC, или ASMA, или calponin.
Какие ИГХ маркеры используются в диагностических панелях при патологии молочных желез
Набор маркеров (диагностическая панель), который используется в ИГХ исследованиях при раке молочной железы, во многом зависит от оснащенности лаборатории, в которой проводится иммуногистохимия, и опыта врача, проводящей ее. Ниже приведены рекомендации, какие ИГХ панели необходимо применять при патологии молочных желез, предоставленные одной из клиник:
- Миозин тяжелых цепей гладких мышц (SMMHC) или calponin — маркеры чувствительны и специфичны к цитоплазме миоэпителиальных клеток;
- Актин гладких мышц может быть использован, но все равно в интерпретации следует учитывать, что он присутствует в фибробластах (воспаление и рубец);
- P63 является чувствительным и специфичным маркером к ядрам миоэпителиальных клеток, но окрашивание может быть прерывистым. Применение маркера к цитоплазме миоэпителиальных клеток, таких как SMMHC или calponin, следует использовать, чтобы не возникли проблемы в интерпретации полученной картины.
При попытке определить наличие или отсутствие миоэпителиальных клеток следует использовать p63 и SMMHC, или calponin.
Роль иммуногистохимии в определении “прогностических” и “предиктивных” факторов при раке молочной железы
Прогностические факторы предоставляют информацию о возможном поведении рака молочной железы на момент его диагностики и не зависят от терапии. То есть с помощью них можно судить, как будет быстро прогрессировать рак и, соответственно, в зависимости от этого принять решение, какой объем и лечение предпочтительны в каждой конкретной ситуации.
В свою очередь, “предиктивные” (предсказывающие) факторы обеспечивают информацией, которая позволяет судить о вероятности ответа опухоли на конкретную терапию. Несмотря на то, что прогностические и предиктивные факторы возможно систематизировать по отдельности, в диагностике и классификации рака молочной железы чаще они являются как прогностическими, так и предиктивными.
Например, наличие высокой экспрессии HER2. Если рак молочной железы her2 положительный (большое количество в опухоли белка HER2), то он протекает агрессивно, с ранним метастазированием в отдаленные органы. А если опухоль содержит малое количество этого белка (рак молочной железы her2 негативный), она не будет реагировать на применение таргетного препарата герцептина.
Рекомендуем прочесть статью о том, что такое люминальный рак молочной железы. Из нее вы можете узнать, как современные методы исследования помогают определить подтипы рака, как выбирают оптимальный метод лечения рака молочной железы в зависимости от результатов исследования. “Базальные” ИГХ маркеры
Существует подразделение рака молочной железы в зависимости то того, какие гены экспрессируют его клетки (профиль экспрессии генов). Опухоли, профиль которых характерен для базальных или миоэпителиальных клеток нормальной молочной железы, будут показывать наличие «базальных» маркеров. Такие опухоли имеют неблагоприятный прогноз. В большинстве из этих «базальных» опухолей полностью отсутствуют ER, PR (рецепторы к эстрогену и прогестерону) и белок HER2. Они часто метастазируют в головной мозг, в легкие.
На сегодня нет консенсуса по иммуногистохимическому профилю (какие ИГХ маркеры должны применяться), который бы четко определял эти «базальные» раки. К этим опухолям с плохим прогнозом относится и так называемый «трижды негативный рак молочной железы», в котором отсутствуют ER, PR и HER2, но экспрессируются базальные цитокератины 5/6 и 14, рецептор эпидермального фактора роста (EGFR) и C-KIT. Они могут также экспрессировать P-кадгерин и часто p63.
Есть сходство между «базальным» раком молочной железы и раками, которые выявляются у женщин с BRCA1 мутацией.
EGFR экспрессируется часто в «базальных» раках, поэтому пациентки с такими опухолями могут извлечь пользу при лечении ингибиторами EGFR.
ИГХ маркеры пролиферации (скорости роста опухоли)
Количество митозов или процент клеток, находящихся в митозе, давно считается морфологическим «биомаркером» прогноза рака. Существует ряд ИГХ маркеров, которые демонстрируют пролиферативную активность клеток (количество митозов):
- Ki67 — антиген, который экспрессируется в ядрах клеток на всех этапах клеточного цикла и является полезным маркером клеточной пролиферации;
- MIB1 — антитело, которое реагирует с Ki-67 в ткани, зафиксированной формалином или парафином;
- PPh3.
ИГХ маркеры апоптоза
Апоптоз или «запрограммированный суицид клетки» является биомаркером агрессивных опухолей. Белки апоптоза можно идентифицировать с помощью ИГХ:
- Bcl-2;
- Вах;
- Bcl-X.
Другие “прогностические” маркеры
- р53. Мутации в гене р53 супрессора опухолей (TP53) выявляются в 20-30% случаях рака молочной железы. Эти генные мутации наблюдаются чаще у женщин с наследственными синдромами рака молочной железы, чем у женщин с спорадическим раком. Для пациентки с генетической предрасположенностью к раку молочной железы может быть рекомендовано р53-тестирование. Обнаружение мутаций в р53 также рассматривается в качестве возможного предсказателя ответа рака молочной железы на химиотерапию, но обнаружение белка р53 иммуногистохимически в опухоли не отражает статус мутации р53.
- Топоизомераза II альфа. Это мишень, на которую направлено действие антрациклина — химиотерапевтического препарата, который часто используется в лечение рака молочной железы.
